一、目的要求 

1. 掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。 

3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項(xiàng)。 二、基本原理 

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 

是一種應(yīng)用**廣泛和**普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的**基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖之用。    高壓蒸汽滅菌： 

主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在一個(gè)密閉和加壓的滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待蒸汽將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡，關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱。此時(shí)蒸汽不溢出，壓力增大，沸點(diǎn)升高，獲得高于100℃的溫度導(dǎo)致菌體蛋白凝固變性，而達(dá)到滅菌的目的。 

三、實(shí)驗(yàn)材料 

1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 

2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三

角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。 

3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等。 四、操作步驟 

（一）玻璃器皿的洗滌和包裝 1．玻璃器皿的洗滌 

玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。 

2．滅菌前玻璃器皿的包裝 

（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包

成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。 

（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作

用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長(zhǎng)度約1~1.5cm。塞棉花時(shí)．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。 

先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長(zhǎng)紙條，然后將已塞好棉花的移液管**放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住**，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。 （二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程 1．液體培養(yǎng)基配制 

     （1）稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基） 

按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。 

（2）溶化 

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，**后補(bǔ)足所損失的水分。 

（3）調(diào)pH 

    調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直**pH達(dá)7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。 

2．固體培養(yǎng)基的配制 

    配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加 

入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱**瓊脂全部融化，**后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。 （三）培養(yǎng)基的分裝 

    根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。 1．試管的分裝 

取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝**試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。 2．三角瓶的分裝 

   用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作 #p#分頁標(biāo)題#e#

平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。 （四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 

    為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。 1．試管棉塞的制作 

制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞．然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。 

制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2／3在試管內(nèi)，1／3在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。 

將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。 2．三角瓶棉塞制作 

通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。 

在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。 （五）培養(yǎng)基的滅菌 

將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，l21℃，20min高壓蒸氣滅菌。 滅菌過程： 

1. 加水：shou先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒過加熱蛇

管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會(huì)發(fā)生燒干引起炸裂事故。 

2. 裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸

汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。 3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，

對(duì)齊螺口，然后以對(duì)稱方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開排氣閥。 

4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排

氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。 

5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開始上升。 6. 保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開始計(jì)時(shí)并維持壓力**所

需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌。 

滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。 

7. 降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力

表的壓力降**“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚**灼傷操作者。 （六）斜面和平板的制作 1．斜面的制作 

將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長(zhǎng)度不超過試管長(zhǎng)度l／2為宜。如制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置**凝固。 2．平板的制作 

將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷**50℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。 

平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，**瓶口正好伸入，傾入10~15mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。 （七）培養(yǎng)基的滅菌檢查 

滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查。**好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天，確定無菌后方可使用。